多年生黑麦草是我国西南区草山、草坡和人工草地建植的主栽草种之一，但其耐热性差，高温易诱导叶片早衰，限制饲草产量和品质。研究组前期发现，高温显著促进了衰老基因NON-YELLOW COLORING 1-like（LpNOL）的表达；RNA干扰（RNAi）LpNOL提高了黑麦草的耐热性，延缓了叶片衰老（如增加了植株的绿色叶片数）。然而，RNAi LpNOL降低了植株的分蘖数和生物量。因此，挖掘并编辑LpNOL启动子中的关键高温响应元件，不仅有助于解析LpNOL响应高温的机理，还能够创制持绿型、耐高温、且不影响分蘖的黑麦草新材料。近日，小宝寻花 徐彬教授研究组在Plant Physiology期刊发表题为Promoter editing of LpNOL generates stay-green perennial ryegrass with improved forage quality and heat tolerance的研究论文。研究鉴定了LpNOL启动子中响应高温的关键元件，并采用基因编辑技术定向编辑高温响应关键区段，创制了耐高温、持绿型黑麦草新材料。

研究发现在高温胁迫下， 12份耐热程度不同的黑麦草种质资源中LpNOL基因表达水平和叶绿素含量呈显著负相关，推测LpNOL启动子中存在高温响应元件。进一步分析发现12份黑麦草种质资源中均存在两个长短不一的LpNOL启动子；但种质资源中LpNOL启动子的遗传变异与叶绿素含量无相关性，表明LpNOL启动子的遗传多样性与各黑麦草种质资源的耐热性无关。MEME基序和顺式作用元件分析表明，LpNOL启动子含有与胁迫相关的顺式作用元件，根据预测结果对LpNOL的长短启动子进行截短，并开展双荧光素酶（LUC）实验，以鉴定高温响应关键元件/区段。实验结果表明在短启动子的-27~-438和长启动子的-1~-448区域含有与热响应相关的顺式作用元件。在该区域设计3个不同的gRNA靶点，定向编辑LpNOL的启动子，其中gRNA3的编辑效率在57.8%-100%，且没有脱靶现象；共创制30余份lpnol突变体材料。

图1. LpNOL启动子中关键高温响应元件的鉴定、基因编辑靶点选择与编辑效率验证

进一步研究发现lpnol突变体株系的分蘖数与野生型（WT）材料相当，基因编辑LpNOL启动子弥补了RNAi-LpNOL（LpNOLi）株系分蘖数减少等缺陷。在离体叶片暗诱导处理后，lpnol株系的总叶绿素含量和叶绿素b/a的值均显著高于WT；在自然衰老实验中，lpnol株系每个分蘖上具有更多的绿色叶片数，表明lpnol株系具有持绿表型。对各突变体株系进行高温处理，发现lpnol株系具有更高的叶绿素含量、叶绿素b/a值和更低的电解质渗漏率（EL），结果表明lpnol株系的高温耐性显著高于WT。此外，lpnol突变株系的粗蛋白（提高41.3%）、脂肪（23.3%）、糖（24.3%）、干物质消化率（13.8%）和中性洗涤纤维含量均显著高于WT，酸性洗涤纤维含量显著低于WT，说明lpnol株系具有更高的饲草品质。

本研究表明，合理的设计启动子编辑可以保留所需的性状，同时避免完全基因敲除/下调带来的副作用，靶向启动子编辑也是多年生黑麦草和其他植物的分子育种重要策略。

图2. lpnol突变体材料的持绿性、耐热性、生物量及饲草品质分析

研究组博士生杨化冻为论文第一作者，徐彬教授和张敬副教授为共同通讯作者。本研究获得中国国家重点研究发展计划、中央高校基本科研业务费和国家自然科学基金等项目资助。

新闻：张敬

校对：宋菲

审核：陈煜